|
Structura consta dintr-o prisma aurita (componenta micro-optica) pe care se depune stratul senzitiv. (fig. 12)
Fig. 12. Structura biosenzorului SPR cu cuplor cu microprisma.
Radiatia paralela cu baza intra in prisma, se reflecta pe stratul de aur si apoi iese din prisma. Radiatia de polarizare p interactioneaza cu undele de suprafata plasmonica la interfata dintre mediu si stratul de aur astfel incat intensitatea semnalului reflectat este atenuata. Principiul de functionare a senzorului realizat se bazeaza pe detectia modificarii intensitatii radiatiei de polarizare p care iese din prisma ca o consecinta a modificarii indicelui de refractie a stratului senzitiv prin atasarea moleculelor biologice ce trebuie identificate.
Proces tehnologic
Structura de prisma cu stratul biologic imobilizat este indicat sa fie de unica utilizare si din acest motiv am optat pentru prisme polimerice obtinute prin replicare avand ca original o prisma de sticla.
Etapele de obtine a structurii de senzor sunt:
1. Realizare original (master)
Originalul este o prisme de sticla cu planul bazei 1cm x 0.5 cm realizata de PRO-OPTICA. Prisma se lipeste cu un adeziv de lamela de sticla (2 x 2 cm2, grosime ~0.7 mm). Lamela este necesara pentru crearea unei “platforme” care sa permita manipularea usoara a prismei
2. Realizare matrita
- Matrita se realizeazeaza intr-un cauciuc siliconic - PDMS (poli-dimetil-siloxane). Prepolimerul Sylgard 184 (Dow-Corning) se amesteca cu intaritorul in raport 10:1. Amestecul se degazeaza timp de 30 minute (pentru eliminarea bulelor de aer) intr-un desicator cuplat la o pompa de vid.
- Originalul de sticla se fixeaza intr-un recipient plasat pe un suport plan (fig. 13 a). Se trateaza suprafat originalului cu agent de demulare 230 Fluid Dow-Corning pentru a permite desprinderea usoara a matritei
- Se toarna prepolimerul amestecat cu intaritor si degazat si se indeprteaza excesul (fig. 13b).
- Se efectueaza tratamentul de intarire a cauciucului 3h la 60 oC
- Se desprinde matrita obtinuta in PDMS de originalul de sticla (demulare)- fig. 13 c
a) b) c)
Fig.13. Etapele de realizare a moldului pentrtru replicarea prismei
a)fixare master si tratare; b) turnare prepolimer +tratament; c) demularea structurii din PDMS
3. Replicare microprisme
Polimerul utilizat pentru realizarea replicilor este o rasina epoxidica Dinox 010S.
Pentru obtinerea prepolimerului se amesteca Dinox 010S cu intaritorul (triethylenetetraamine) in raport 10:1. Etapele tehnologice sunt: (fig. 14)
- Se trateaza tratare suprafata matritei cu agent de demulare
- Se toarna solutia de prepolimer+intaritor si se tratateaza termic la 80 oC, 30 min tratament termic (fig. 14.b)
- Se desprinde replica de mold (fig. 14.c)
a) b) c)
Fig. 1.4. Etapele de realizare a moldului pentrtru replicarea prismei
3. Depunere si configurare Au
Se depune un strat de Au de 40 nm prin sputttering (eventual peste un strat de Cr de aprx. 5 nm pentru imbunatatirea adeziunii)
Fig. 15. Imagini ale prismelor – aurite si neaurite.
4. Depunere strat senzitiv
In cazul utilizarii structurii ca senzor chimic substanta de analizat trebuie sa vina in contact direct cu suprafata aurului. In cazul functionarii ca senzor biologic pe suprafata stratului de Au este necesar sa se depuna un strat un strat senzitiv in care sunt imobilizate molecule de recunoastere (anticorpi, secvente de ARN sau ADN, enzime, etc.)- fig. 12.. Atunci cand moleculele “tinta” din solutia de analizat se ataseaza de moleculele de recunoastere din statul senzitiv, proprietatile optice (indicele de refractie) al stratului senzitiv se modifica si conditia de rezonata va fi indeplinita pentru o alta valoare a unghiului de incidenta.
S-au elaborat metode de depunere a unui strat de colagen pentru a identifica molecule de anticolagen. metode care pot fi apoi usor adaptate pentru imobilizarea altor proteine.
Imobilizarea moleculelor de colagen pe suportul de aur se poate face prin doua metode:
- Direct : prin micropipetrea uniforma a colagenului( pH=5) pe suprafata de aur
- Utilizand un strat auto-asamblat (SAMs) de alcantiol (acidul 11-mercaptoundecanoic-11MUA) ca strat de legatura intre suprafata de aur si cea de colagen.
i) Metoda directa
- Inainte de fiecare utilizare substratul de aur se curata in plasma (parametrii de lucru: gaz de lucru: O2 75 sccm, presiune 20 Pa, putere RF 100W, timp 4 min), apoi spalat cu etanol, apa deionizata si uscat cu azot.
- Se pipeteaza pe suprafata de Au curata 15μl de colagen(pH=5)
- Se pastrat la 40C timp de 12
Fig. 16. Colagen depus direct pe stratul de Au functionalizat in plasma
ii) Metoda cu strat intermediar de tip SAM
Pentru auto-asamblarea moleculara se utilizeaza recipienti din sticla spalati in prealabil in solutie oxidanta piranha (30% H2O2 si 70% H2SO4).
Solutia de 11-MUA 2mM in etanol, a fost pusa in contact pentru 12h cu substratul de Au. Chimia adsorbtiei este data de reactia:
unde R= COOH
- In urma procesului de auto-assamblare moleculara a moleculei de tiol pe suprafata de aur, se formeaza legaturi puternice Au-S si un strat molecular terminat cu grupari COOH. Stabilitatea si taria legaturii Au-S este data pe langa puternica chemisorptie a sulfului pe suprafata aurului si de interactiile Van der Waals intre lanturile hidrocarbonate ale monostratului alchil imobilizat pe suprafata.
- Gruparile terminale COOH se activeaza folosind o solutie realizata in tampon fosfat (pH=7) cu urmatoarea compozitie: 0.002 M hidroclorura de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC), 0.005 M N-hidroxisulfosuccinimida (Sulfo-NHS) si colagen(pH=5, 5μl). In scopul legarii ireversibile a moleculei de colagen pe substratul functionalizat, reactia a avut loc la temperatura de 40C timp de 12h, la intuneric. Molecula de EDC reactineaza cu gruparea carboxil terminala de pe suprafata de aur si formeaza un intemediar instabil, care, daca nu intalneste o amina va regenera gruparea carboxilica. In prezenta de (Sulfo-NHS), se formeaza un amino-NHS ester care va fi susceptibil la atacul nucleofil al gruparilor amino- din molecula de colagen.
Fig 17. Schema modificarii suprafetei de aur functionalizate cu 11-MUA cu molecula de colagen.
Aplicatii: Procesele elaborate au fost aplicate la realizarea de senzori de alcool si pentru detectia anticolagenului.
|
