MultiplexGen

Platforma integrata pentru genotiparea multiplexata a HPV – ului

Finantat de:

***************
Rezultate preliminare (Decembrie 2016)

Eficiența imobilizării secvențelor control de suprafețe de Au, în prezența/absența mercaptohexanolului
fig. 1. Semnal de imobilizare dinaintea etapelor de procesare a biochip-urilor
	În Figura 1 este cuantificat semnalul de imobilizare cu software-ul Gene Pix Pro, intensitățile de semnal care corespund replicilor tehnice de pe cele două chip-uri fiind transpuse într-o reprezentare grafică imobilizării secvențelor control pe suprafețele de Aur. Se observă în cazul de față că incubarea mixului de ADN cu mecaptohexanol în soluție de imobilizare duce la o dispersare a valorilor de semnal, pe când în cazul incubării ADN control cu buffer de imobilizare, intensitățile de imobilizare date de replicile tehnice sunt mult mai uniforme.
Eficiența hibridizării secvențelor-țintă de sondele corespunzătoare genei E1, care au fost construite să conțină un spațiator cu 3 sau cu 6 atomi de carbon (C3 sau C6)
Figura 2: Influența lungimii spațiatorului în eficiența reacției de hibridizare
Cuantificarea semnalelor de hibridizare după 15 h de incubare a fost realizată cu software-ul Gene Pix Pro, intensitățile de semnal care corespund replicilor tehnice de pe un biochip fiind transpuse într-o reprezentare grafică (Figura 2). Din analiza grafică se observă că spațiatorul cu 6 atomi de carbon are un impact pozitiv asupra hibridizării, în sensul că intensitatea semnalului fluorescent este mai ridicată (mai multe molecule țintă s-au atașat de sondele ADN) și mai uniformă.	................
Realizarea  matrițelor pentru sistem de canale în PDMS
Figura 3. Matrița de siliciu cu canale definite pentru o structură test
	Definirea geometriei canalelor a fost realizată prin realizarea unui proces fotolitografic, prin deschiderea în fotorezist a unor ferestre prin care a fost corodat oxidul de siliciu/ sticla. Canalele în PDMS au fost definite cu ajutorul matriței.

***************
Rezultate preliminare (Decembrie 2014)

• Au fost stabilite protocoale de functionalizare a suprafetelor pentru imobilizarea probelor AND.
• Au fost stabilite protocoale de extractie pentru AND uman.
• S-au recoltat probe de la paciente (cu accordul informal al acestora) pentru constituirea unei banci de probe specific pentru genotipurile de HPV cele mai fracvent intilnite.
• Au fost stabilite secventele cu rol de control pozitiv si respective negative atit prin selectarea de probe reale cit si prin definirea unor controale positive sintetice.
• A fost obtinut un substrat tridimensional cu rol de amplificare a semnalului florescent obtinut la procesarea probelor si deci o crestere a sensibilitati structurilor test ( chip-uri test)
• A fost stabilit un protocol de marcare florescenta a probelor pentru analiza florescenta a rezultatelor.

***************
Rezultate estimate

Ca rezultate asteptate, consideram in mod egal contributiile aduse la stiinta fundamentala cat si cele de dezvoltare tehnologica orientata catre un sistem de detectare a HPV complet. Avem convingerea ca abordarile propuse, stabilite pe baza unei analize riguroase a ideilor cele mai noi in domeniul proiectului si, de asemenea, al tuturor ariilor tematice aflate in conexiune, vor da raspunsuri la unele dintre problemele actuale. Detectarea corecta a unui numar mare de subtipuri HPV reprezinta in fapt criteriul de succes al proiectului nostru, avand in vedere ca la momentul actual kit-ul comercial este limitat numai la  35-44 tipuri de virusuri.

Problemele propuse spre rezolvare raportate la tematica abordata includ cunostinte fundamentale si tehnologice si constituie parti ale modelului demonstrativ functional propus, dupa cum urmeaza:

• obtinerea unei tehnologii ‚microaray’ de genotipare corecta a HPV;
• imbunatatirea rezultatelor raportate pana acum in ceea ce priveste senzitivitatea si selectivitatea prin conectarea biochip-ului la un sistem microfluidic;
• obtinerea unui design  optim pentru biochip, care sa permita detectarea paralela si, astfel, sa fie asigurata confirmarea rezultatelor;
• propunerea unei tehnologii de integrare eterogena si incapsulare 3D, si implicit obtinerea unui ansamblu hibrid functional al modulelor de baza pentru dezvoltarea unui sistem care sa fie gata pentru utilizare.

Rezultate preconizate:

• dispozitivul  functional integrat de tip sistem „multilevel”;
• biochip-ul multiparametric;
• tehnologia microarray adaptata pentru genotiparea multiplexata a HPV
• tehnologia microfluidica adaptata pentru marcarea ADN-ului si spotarea capilara; si chiar
• toate sintezele (bio)chimice, functionalizarea selectiva a suprafetei si, de asemenea masuratorile special propuse – unele dintre ele cu un acces international limitat.

[inapoi la pagina principala]

Proiect coordonat de:

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microtehnologie- IMT Bucuresti http://www.imt.ro/

Proiect in parteneriat cu:

• Genetic Lab SRL
• Universitatea Politehnica din Bucuresti, Centrul de Cercetare pentru Chimie Organica Aplicata
  

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microtehnologie- IMT Bucuresti
Director de proiect: Dr. Mihaela Kusko (Miu)
E-mail: mihaela[dot]miu[at]imt[dot]ro
Tel:  +40-21-269.07.70; +40-21-269.07.74;
Fax: +40-21-269.07.72; +40-21-269.07.76;
Website: www.imt.ro