Program Operational Sectorial "Cresterea Competitivitatii Economice"
"Investitii in viitorul dumneavoastra"

■ REZULTATE ETAPA a 14-a

În această etapă de raportare, conform calendarului activităţilor proiectului, s-au desfăşurat în paralel și au fost finalizate trei activităţi de dezvoltare experimentală:  

„Elaborarea tehnologiilor de fabricaţie a platformelor microfluidice” -
Activitatea 1.D – Tehnologie de realizare a canalelor microfluidice prin metoda straturilor de sacrificiu (Andrei Avram, Marioara Avram).

„Testare experimentala” –
Activitatea 4.C - Elaborare experimentala: asamblarea containelor lipide în sisteme microfluidice (Ciprian Iliescu, Cătălin Bălan, Cătălin Mărculescu, Radu Popa, Antonio Rădoi).

Activitatea 4.D - Caracterizarea lipozomilor și a substantelor active incapsulate în lipozomi (Ciprian Iliescu, Cătălin Bălan, Cătălin Mărculescu, Antonio Rădoi, Adina Brăgaru).

*************

1.

În această etapă se raportează trei activităţi principale de dezvoltare experimentală, care s-au derulat în paralel în perioada 21 octombrie 2013 și 20 ianuarie 2014, finalizate cu testarea caracteristicilor dispozitivelor demonstratoare ale tehnologiilor implementate.

Rezultatele principale:

1. Caracterizarea și testarea dispozitivelor demonstratoare ale tehnicilor de microfabricaţie dezvoltate în acest proiect: dispozitivul magnetoforetic pentru manipularea magnetolipozomilor, dispozitivul dielectroforetic pentru separarea lipozomilor autoasamblați după permitivitatea dielectrică și a dispozitivelor microfluidice pentru obţinerea lipozomilor prin focalizare hidrodinamică. Raportăm câteva elemente de succes și anume dezvoltarea în premieră a unor tehnologii modernizate pe baza cărora au fost realizate două tipuri de dispozitive pentru manipularea și caracterizarea lipozomilor, un dispozitiv impedimetric pentru separarea lipozomilor după constanta dielectrică și un tip de dispozitiv bipolar şi unul quadripolar pentru manipularea magnetolipozomilor.
   
2. Metodele experimentate pentru obţinerea și asamblarea lipozomilor cu dimensiuni submicronice controlate în canale microfluidice prin focalizare hidrodinamică. Sistemul este alcătuit din microcanale dispuse sub formă de joncțiuni de tip „Y” și „T”. Simulările numerice au relevat că, din momentul în care procesul de amestec este preluat de difuzie, lungimea canalului trebuie să fie suficient de mare pentru a asigura o concentrație scăzută și relativ uniformă a etanolului în secțiunea transversală la capătul de ieșire al canalului microfluidic. Simulările numerice au fost verificate prin vizualizări / măsurători µPIV.
   
3. Metodele experimentate pentru caracterizarea lipozomilor asamblați în canale microfluidice prin focalizare hidrodinamică. Caracterizările lipozomilor au fost realizate utilizând dispozitivul impedimetric dezvoltat în cadrul proiectului. Au fost realizate experimentele privind caracterizarea lipozomilor, prin determinarea variației cu frecvența aplicată pe senzorul impedimetric al permitivității dielectrice, a transferului de sarcină transmembranar, a polarizabilității și a factorului Clausius Mossotti.

Aplicatie 1: Caracterizarea dispozitivului impedimetric pentru determinarea constantei dielectrice a lipozomilor autoasamblati

Caracterizarea lipozomilor cu ajutorul dispozitivului dezvoltat în cadrul proiectului a fost realizată prin spectroscopie de impedanță electrochimică. La aplicarea unei tensiuni electrice între electrozii de lucru ai senzorului de +350mV și respectiv -350mV, pe digitii unuia dintre electrozi, anodul, se produce o reacție de oxidare cu eliberare de electroni, iar pe digiții celuilalt are loc o reacție de reducere cu captare de electroni, iar interfața solid – lichid se comportă ca un condensator. Cu cât interfața este mai mare, cu atât capacitatea crește, ceea ce determină o aplatizare a picăturii inițiale, respectiv o scădere a unghiului de contact.

Vom prezenta în continuare două tipuri de caracterizări: caracterizări ale lipozomilor în funcție de impedanța electrochimică, realizate cu ajutorul Spectrometrului de Impedanță Electrochimică (Fig.1.2 și 1.3) și caracterizări ale lipozomilor rezultate din prelucrarea rezultatelor experimentale obținute cu ajutorul Spectrometrului de Impedanță Electrochimică.

Primul tip de caracterizări se găsesc în acest capitol (figura 1.2 și 1.3), pentru a demonstra funcționalitatea dispozitivului dezvoltat în acest proiect. În figura 1.2 a fost reprezentată diagrama Nyquist a impedanțelor pentru dispozitivul cu 33 de perechi de electrozi interdigitați, iar în figura 1.3 a fost reprezentată grafic variația modulului impedanței și a fazei în funcție de frecvență.

Al doilea tip de caracterizări se vor discuta în capitolul al doilea, unde vom caracteriza lipozomii din punct de vedere al permitivității dielectrice, folosind dispozitivul descris în acest capitol.

În diagrama Nyquist (fig. 1.2) este reprezentată impedanța reactivă capacitivă imaginară în funcție de reactanța reală. Din curba semicirculară corespunzătoare frecvențelor mari se poate determina rezistența transferului de sarcină și capacitatea stratului dublu electric care apare la suprafața membranei lipidice, dar se poate determina modulul impedanței corespunzătoare rezonanței impedanțelor corespunzătoare maximului curbei semicirculare. Variația liniară a impedanței imaginare în funcție de impedanța reală corespunzătoare frecvențelor mici se datorează difuziei Warburg.

Figura 1.2. Diagrama Nyquist a impedanțelor pentru o  soluție de lipozomi

Figura 1.3. Diagrama Bode a unei soluții de lipozomi.
Cu albastru este reprezentată variația modulului impedanței, iar cu verde variația fazei.

În diagrama Bode (fig. 1.3) este reprezentată variația modulului impedanței în funcție de frecvență și variația fazei în funcție de frecvență. Din această diagramă și modulul impedanței determinat din diagrama Nyquist putem determina frecvența de rezonanță.

Aplicatie 2: Caracterizarea dispozitivelor magnetoforetice pentru manipularea magnetolipozomilor

Incapsularea dispozitivelor magnetoforetice

Pentru încapsularea dispozitivelor s-au folosit plachete de sticlă Pyrex 7740 cu diametrul de 4” și grosimea de 0,7 mm. Pentru a creşte rata de succes a încapsulării, plachetele procesate de siliciu şi sticlă au fost trasate în cipuri de 2 cm x 2 cm. S-au testat două metode de încapsulare: (1) sudură anodică, (2) lipire prin strat intermediar.

Încapsularea prin sudură anodică s-a făcut în sistemul BA6 (Suss MicroTec), achiziționat în cadrul proiectului. În sistem a fost introdus un singur cip împreună cu capacul de sticlă aferent. Pentru a evita difuzia aurului și pentru a nu afecta funcţionalitatea traseelor metalice, s-a testat un proces nou de sudură anodică. Parametrii de proces au fost:  T = 280oC, U = 2000 V, p=800 N/m2.

 Calitatea sudurii a fost testată prin introducerea unei lame de bisturiu între capacul de sticlă şi cipul de siliciu. În urma testelor efectuate am constatat o sudură de bună calitate, fără defecte vizibile. În figura 93 este prezentat un cip încapsulat prin metoda sudurii anodice.

Calitatea lipirii a fost testată prin introducerea unei lame de bisturiu între capacul de sticlă şi cipul de siliciu. În urma testelor efectuate am constatat o sudură de calitate suficient de bună. Lipirea nu a fost suficient de uniformă pe toată suprafaţa, dar nu apar defecte vizibile în zona microcanalului fluidic. În figura 1.5 este prezentat un cip încapsulat prin metoda lipirii cu strat intermediar.

Figura 1.4: Dispozitiv bipolar încapsulat prin metoda sudurii anodice, expus în comparaţie cu o monedă de 10 bani. Nu sunt vizibile defecte de încapsulare

Figura 1.5: Dispozitiv cuadripolar încapsulat prin metoda lipirii cu strat intermediar. Sunt vizibile defecte de lipire în marinea dispozitivului, fără să afecteze zona de circulaţie a fluidului

Contactarea traseelor electrice
Contactarea traseelor metalice s-a făcut prin lipirea unor fire de cupru cu pastă conductoare pe bază de argint. Sudura firelor cu sistemul specific s-a dovedit ineficientă, deoarece în timpul lipirii se rup filmele metalice subţiri de pe cip. Acest fapt se datorează lipsei aderenţei dintre metale şi capacul de sticlă. În figura 1.6 sunt prezentate dispozitive bipolare și cuadripolare cu firele electrice ataşate.

Figura 1.6: Dispozitiv bipolar (stânga) și cuadripolar (dreapta) cu fire conductoare ataşate

Experimente de separare magnetoforetică

Pentru testarea dispozitivelor fabricate, s-a instalat un set-up experimental format dintr-un microscop inversat cu cameră digitală pentru înregistrarea imaginilor în timp real şi o sursă de curent constant (figura 1.7).

În timpul experimentelor, pentru observarea forţei magnetoforetice, s-au folosit particule de maghemită, cu diametrul de 10 nm, suspendate în apă deionizată, concentraţia soluţiei obţinute fiind de aproximativ 50%. Dispozitivele au fost fixate pe un suport izolat electric, deasupra ocularului microscopului, precum este prezentat în figura 1.8.

Fluidul de lucru a fost introdus în microcanale prin aplicarea unei picături de fluid pe orificiul de intrare, curgerea având loc prin efect de capilaritate. După intrarea fluidului în microcanal, s-a aplicat pe traseele electrice curent continuu constant.

Datorită unor defecte apărute la pasul de lipire a capacului de sticlă, în timpul experimentelor s-a constatat etanşarea defectuoasă a microcanalelor fluidice. Astfel, fluidul cu suspensia de particule magnetice a pătruns prin capilaritate și în afara microcanalului. La aplicarea câmpului electric, nanoparticulele magnetice au tendinţa de a se aglomera în apropierea pereţilor laterali, în dreptul traseelor conductoare. Acest lucru poate fi observat atât în zona de îngustare a microcanalului (figura 1.9), cât și în dreptul traseului electric în apropierea padurilor de contactare.

În figura 1.9, se poate observa efectul convecţiei termo-capilare, aşa numitul efect Benard-Marangoni. Fluidul care a fost introdus în dispozitiv prin capilaritate, se deplasează la suprafaţa dispozitivului datorită creşterii temperaturii, sub formă de picături alungite. Aceste picături, în mişcarea lor, antrenează nanoparticulele captate la marginea traseelor conductoare.

Figura 1.7: Set-up experimental pentru vizualizarea separării magnetoforetice		Figura 1.8: Amplasarea dispozitivului pe microscopul inversat. Se pot observa conectorii electrici către sursa de curent continuu

Figura 1.9: Vizualizare a zonei cu trasee îngustate în timpul separării magnetoforetice

Sistem microfluidic cu joncțiuni de tip  „Y” și  „T” pentru formarea picăturilor cu dimensiuni controlate

Studiul se referă la o procedură de obținere a picăturilor cu dimensiuni submicronice controlate, utilizând fluide imiscibile, dar și pentru crearea altor formațiuni biocompatibile, cum ar fi lipozomii. O parte a acestui studiu a fost inceput si raportat in raportul 10.

Sistemul este alcătuit din microcanale dispuse sub formă de joncțiuni de tip „Y” și „T”. Aplicația prezintă comportamentul a două fluide imiscibile în acest sistem de microcanale prin determinarea dinamicii formei interfeței ce se manifestă la diferite numere ale capilarității (Ca), apelând la variația rapoartelor debitelor pe cele două intrări.

În dinamica fluidelor, acest număr al capilaritatii reprezintă efectul relativ al fortelor vâscoase raportat la tensiunea superficială (interfacială) care acționează la interfața dintre un lichid și un gaz sau între două lichide imiscibile. Acest număr adimensional este direct proporțional cu vâscozitatea (η0) și viteza medie (v), și invers proporțional cu tensiunea superficială (σ).

Rezultatele numerice au fost comparate cu o investigație experimentală, realizată cu o instalație cu design special, micro-PIV, bazată pe un dispozitiv microscopic optic (o camera CCD a fost atasata la obiectivul unui microscop inversat). Utilizând această configurație, s-au obținut vizualizări directe și observatii cantitative. Din această investigație a reieșit faptul că, cu cât numărul capilarității este mai mare, cu atât picăturile formate sunt mai mici.

Figura 2.3. A) Vizualizari experimentale ale formarii picăturii; B) Reprezentari calitative ale campului de curgere în interiorul picăturii de apa obtinute cu sistemul de masurare micro-PIV;  C) Reprezentari numerice ale interfetei.

Difuzia în sisteme de microcanale pentru focalizarea hidrodinamica

Geometriile 3D și discretizarile ortogonale și structurate ale domeniilor de curgere au fost generate utilizând preprocesorul GAMBIT (ANSYS®). Mesh-ul a constat în: 1339200 elemente finite hexaedrale, respectiv 1.188.000 elemente finite hexaedrale pentru geometriile de focalizare centrală (1- cu o lungime a canalului de ieșire de 0.85 mm și 2 – cu o lungime a canalului de ieșire de 3mm), și 577300 elemente finite hexaedrale pentru geometria de focalizare laterală. Curgerea 3D a fost simulată utilizând pachetul CFD Fluent (ANSYS®).

Simulările s-au derulat în conditii de curgere laminară izotermă, cu fluide de lucru Newtoniene și având un criteriu de convergență de 10-10 cu dublă precizie. S-a folosit metoda numerică Volume of Fluid, cu o soluție de etanol de 35% injectată pe intrarea principală și apa pe intrările laterale de focalizare. Rapoartele debitelor au fost 5/45 pentru focalizarea centrală și 5/20/20 pentru focalizarea laterală, luând în considerare debitul intrării principale și respectiv, debitele intrărilor de focalizare. Pentru o simulare cât mai precisă s-a introdus o funcție de difuzie sub forma unui scalar definit de utilizator (UDS) și parametri specifici de material.

Simulările au fost dezvoltate pentru a stabili lungimea corectă a canalului microfluidic pentru a obține la ieșirea din canal o soluție  cât mai omogenă pentru cazul de focalizare centrală. Din momentul în care procesul de amestec este preluat de difuzie, lungimea canalului trebuie să fie suficient de mare pentru a asigura o concentrație scăzută și relativ uniformă a etanolului în secțiunea transversală la capătul de ieșire al canalului microfluidic.

Pentru vizualizarea procesului de amestec, au fost selectate patru secțiuni transversale la intervale fixate. Primul punct a fost selectat foarte aproape de zona de joncțiune și implicit de focalizare (70 µm). În aceasta secțiune se observă un gradient foarte mare de concentrație (0-35%) în ambele cazuri. Din momentul inceperii procesului de difuzie, fasciculul principal de curgere devine din ce în ce mai dispersat și mai putin vizibil, datorită evoluției procesului de amestecare. Valoarea maximă a concentrației de etanol descrește de asemenea (de la 35% - valoarea inițială – la 16% după 0.8 mm pentru primul caz, 14% după 1 mm în al doilea caz, urmând la 7% după 2 mm și 4.7%, după 3 mm).

Din punct de vedere calitativ, în cazul focusarii hidrodinamice laterale cu 2 intrari de focalizare, se observa o imbunatatire a difuziei fasciculului principal focusat în restul volumului de fluid, comparativ cu prima geometrie de focalizare centrala.

Figura 2.4. Difuzia intr-un canal de focusare hidrodinamica centrala cu lungimea canalului de iesire de 0.85 mm.

Figura 2.5. Difuzia intr-un canal de focusare hidrodinamica centrala cu lungimea canalului de iesire de 3 mm.

Caracterizarea lipozomilor obţinuţi

Rezultatul interacției lipozomilor cu câmpul electric local, prin inducerea unei separări a sarcinilor cu formarea unor noi dipoli, reprezintă apariția polarizării induse. În sistemele biologice există două exemple importante de polarizare indusă: migrarea ionilor pe suprafața macromoleculelor, cu alte cuvinte migrarea indusă de câmpul electric și polarizarea interfacială Maxwell – Wagner a suprafețelor neconductive. Biomaterialele sunt compuse din molecule care prezintă diferențe mari de permitivitate și conductivitate. Când se aplică un câmp electric unui astfel de material, mobilitatea purtătorilor de sarcină, cum ar fi ionii, este considerabil mai mare în unele regiuni (de exemplu fazele apoase) în comparație cu alte regiuni (cum ar fi fazele lipide). Aceasta duce la apariția unei distribuții de sarcină neuniformă pe suprafețele neconductive.

Astfel de sisteme heterogene prezintă proprietăți puternic dependente de frecvență, care sunt diferite de proprietățile constituenților fazei. În concluzie, acumularea sarcinilor electrice la membrana lipidică poate produce un proces de relaxare interfacial de tip Maxwell-Wagner. Acest fapt este observat experimental, cu ajutorul dispozitivului dezvoltat, prin centrarea dispersiei, din curba permitivităţii imaginare, în zona frecvenţelor scăzute. În trecut, modelul principal pentru simularea relaxării interfaciale era modelul unilamelar, care lua în considerare numai membrana lipidică, interiorul apos și mediul de suspensie.

Proprietățile dielectrice ale membranei lipidice au fost caracterizate prin spectroscopie de impedanță electrochimică în domeniul frecvențelor cuprinse între 0,1 Hz și 1 MHz. A fost observată și dispersia dielectrică (pierderile dielectrice) în același domeniu de frecvențe. Aceste pierderi au originea în procesul de polarizare interfacială de tipul Maxwell – Wagner între membrana lipidică și faza ionică apoasă.

În cazul studiului nostru asupra permitivității dielectrice a lipozomilor la frecvențe în domeniul 0,1 Hz – 1 MHz, există două tipuri de dispersii, așa cum se arată și în figura de mai sus: dispersia α pentru frecvențe mai mici de 100Hz și dispersia β pentru frecvențe mai mari de 100 Hz. Dispersia α la frecvențe joase se manifestă printr-o creștere importantă a permitivității dielectrice la frecvențe joase și printr-o mișcare a ionilor tangențial cu suprafața membranară. Mărimea dispersiei  α se traduce de obicei printr-o densitate mare de sarcini fixe la nivelul membranei lipidice, care se datorează procesului de relaxare a ionilor interfaciali. Dispersia β apare la frecvențe mai mari și se datorează proceselor de polarizare interfacială de tipul Maxwell – Wagner dintre membrană și faza ionică apoasă.

Din curba care indică variația factorului Clausius – Mossotti cu frecvența se observă ca lipozomii au o polarizabilitate maximă în domeniul frecvențelor foarte mici, sub 2 Hz și este negativă la frecvențe mai mari, ceea ce înseamnă că permitivitatea dielectrică a soluției de suspensie devine mai mare decât permitivitatea dielectrică a lipozomilor. La frecvențe centrate pe 1 MHz permitivitatea dielectrică a lipozomilor devine comparabilă cu permitivitatea dielectrică a mediului de suspensie, ceea ce înseamnă că la frecvențe foarte mari membrana lipidică devine permeabilă pentru ioni și cu cât crește frecvența cu atât membrana lipidică este mai conductivă. În concluzie la frecvențe foarte mari membrana lipidică se comporta pur dielectric, iar la frecvențe mici se comportă ca un conductor.