Rezultate

                                                                                                   Etapa 3 , Etapa 2, Etapa 1

Proiect PN II PCCA, nr. 30/2014
Sistem micro-electro-fluidic pentru separarea si electroporarea celulelor biologice MEFSYS

Etapa de executie nr. 4 / 2017: Teste experimentale pentru evaluarea functionalitatii microsistemului

Principalele rezultate obtinute in  aceasta etapa sunt:

  • Sinteza biconjugatelor: nanoparticule feromagnetice cu anticorpi specifici celulari
  • Rezultate de caracterizare a microsistemului prin tehnici microfizice
  • Rezultate experimentale de separare si electroporare
  • Rezultate electrice si optice privind functionalitatea modelului experimental

Imagine optica - Incinta si canal microfluidic in sticla

Imagine optica
Electrozi Cr-Au pe siliciu

Profil canal corodat izotrop

Sistem procesare celule cervicale dupa recoltare

Strat limfocite T separat prin metoda Histopaque

Limfocit T CD3 marcat cu NP-antiCD3

Montaj experimental cip si conectori

 

Variatia rezistentei pentru microsistem cu solutie si celule cervicale inainte si dupa electroporare

 

Variatia capacitatii pentru microsistem cu solutie si limfocite inainte si dupa electroporare

Imagini de fază reconstruite pentru proba-martor limfocite

 

 

Obiectivele propuse pentru prima etapa au fost indeplinite iar rezultatele au fost diseminate in pagina web a proiectului www.imt.ro/mefsys si in doua comunicari stiintifice, din care un articol in revista indexata ISI si o comunicare la conferinta internationala.

 

Etapa de executie nr. 3/2016: Sinteza, functionalizare si caracterizare nanoparticule, realizare microsistem, elaborare metodologii de testare

In  aceasta etapa au fost obtinute urmatoarele rezultate:

Au fost proiectate doua variante noi ale microsistemului, pentru care s-au efectuat simulari electrostatice si de manipulare a celulelor prin dielectroforeza. Au fost proiectate masti si realizate variante de electrozi pe suport de sticla si canale in siliciu. Au fost sintetizate si caracterizate nanoparticule cu / fara acoperire cu aur si a fost realizata sinteza biconjugatelor - nanoparticule feromagnetice cu doua tipuri de anticorpi specific celulari. Au fost elaborate metodologii preliminare pentru separarea celulelor, pentru detectie electrica si pentru detectie optica.

 

Geometria 3D pentru varianta de microcanal ramificat cu noua configuratie de electrozi

Variatia frecventei de prag a celulelor ca urmare a electroporarii

 

Distributia campului electric in sectiune pe Z la 100 µm distanta fata de electrozi

Imagine SEM: Nanoparticule acoperite cu aur

Masca pentru placheta de electrozi pentru canale ramificate

Spectrele FTIR ale nanoparticulelor feromagnetice hibride Fe3O4@Au înainte (A) şi după cuplarea cu anticorpi anti-CRP (B)

 

Canal realizat prin corodare uscata in siliciu

.

Profilele de fază in celule cervicale: curba verde - celula normala, curba rosie - celula anormala

Imagini de faza obtinute prin microscopie holografica digitala: a) celule cervicale normale; b) celule cervicale anormale

 

Etapa 2/2015: Optimizare si realizare microsistem, sinteza nanoparticule, preparare celule, elaborare metodologii si teste preliminare

In  aceasta etapa au fost obtinute urmatoarele rezultate:

- Proiectare si simulari cuplate pentru microsistem optimizat cu componentele integrate pentru doua variante
- Proiectare masti, proiectare si realizare tehnologica a variantelor 1 si 2;
- Elaborare protocol de preparare a celulelor pentru electroporare, preparare celule si caracterizare in vitro inainte de electroporare;
- Experimente preliminare privind sinteza nanoparticulelor feromagnetice acoperite cu aur, caracterizare nanoparticule  prin XRD si UV-VIS;
- Experimente preliminare privind functionalizarea orientata a nanoparticulelor feromagnetice in scopul formarii eficiente a bioconjugatelor si caracterizarea preliminara a suprafetei nanoparticulelor functionalizate  prin SEM, XRD, FTIR;
- Elaborare metodologie de detectie prin procesare imagini 3D;
- Teste preliminare de vizualizare a celulelor atasate, inainte de electroporare prin imagistica holografica;
- Diseminare: actualizare pagina web, 8 comunicari stiintifice.

 

                         a)                                                                       b)

Distributie camp electric la 10 V: a) canal drept; b) canal ramificat

  
 

Masca (Clewin) si structura microfluidica in sticla (imagine optical)

  

 

 

 

 

 

  

Spectrul UV-VIS al nanoparticulelor feromagnetice acoperite cu Au obţinute

  
 

Spectrul de raze X al nanoparticulelor magnetice funcţionalizate

  
 

Imagini SEM ale nanoparticulele magnetice acoperite cu Au, functionalizate

  
 

Sectiune transversala prin harta de faza a unei celule cervicale modificate (anormala)

  
 

Imagine 3D pentru o celula cervicala anormala obtinuta prin microscopie holografica digitala, fara markeri de colorare.

Principiul dilatării
(metoda Bouligand-Minkowski)

  

Obiectivele propuse pentru etapa II au fost indeplinite iar rezultatele au fost diseminate in pagina web a proiectului www.imt.ro/mefsys si prin comunicari stiintifice.

 

Etapa 1: Specificatii de proiectare microsistem

In  aceasta etapa au fost obtinute urmatoarele rezultate:

Din punct de vedere tehnic si optic:

- Specificatii initiale de proiectare a microsistemului.
- Stabilirea cerintelor tehnice si optice pentru vizualizare prin imagistica holografica
- Rezultate de proiectare variante constructrive de electrozi.
- Rezultate de simulare electrostatica si microfluidica pentru variantele initiale; analiza distributiei de camp electric in raport cu cerintele de separare prin dielectroforeza si electroporare; analiza distributiei concentratiei celulelor (curgere si dielectroforeza).
- Rezultate de proiectare a unor configuratii optimizate in functie de analizele de simulare ale variantelor initiale.
- Specificatii de proiectare microincinte pentru vizualizare in imagistica holografica: variante constructive cu geometrie asimetrica, respectiv cu focalizare hidrodinamica.
- Rezultate de simulare electrostatica a microsistemului optimizat din punct de vedere al eficientei electrozilor.
- Metoda preliminara si criterii de recunoastere a caracteristicilor celulelor in imagini 3D reconstruite din microscopie holografica.

Layout 2D a variantei de baza a microsistemului: incinte (intrare/iesiri), microcanal, microelectrozi

Structura 3D discretizata in vederea simularii electrostatice: canal si electrozi (varianta constructiva)

Rezultate de simulare electrostatica: distributia campului electric (V/μm) in 3 sectiuni

Rezultate de simulare electrocinetica (curgere si dielectroforeza): Distributia concentratiei celulelor (limfocite T, μMoli/l)

Proiectare microincinte pentru vizualizare in imagistica holografica: Varianta cu doua iesiri, respectiv cu trei intrari pentru folcalizare hidrodinamica

Din punct de vedere biologic:

- Specificatii cerinte tehnice pentru atasarea nanoparticulelor: metode de realizare a bioconjugatului nanoparticule feromagnetice-anticorp, stabilirea etapelor de realizare atasarea nanoparticule pe substrat pentru captarea si cuantificarea celulelor.
- Specificatii celule care vor fi utilizate in experimente: evaluarea proprietatilor pentru celule endocervicale si limfocite.
- Rezultate de evaluare preliminara pentru sinteza nanoparticulelor (NP): strategii de obtinere a nanoparticulelor magnetice - Metoda de sinteza in medii omogene, metoda de sinteza in medii neomogene, metoda de preparare a nanoparticulelor magnetice cu invelis-miez de Fe3O4@SiO2@Au.