Proiect component 1 - Screening prenatal neinvaziv folosind ADN fetal liber circulant extras din sânge matern

Protocol pentru scaderea limitei de detactie

Răspunsul SPR comparativ între soluția blank constituită din H1și H2 diluat în soluție de hibridizare și proba constituită din 1 µM amplicon și câte 0,5 µM H1 și H2, diluate în soluție de hibridizare	Răspunsul SPR pentru 1 µM și 0.1 µM secvență țintă

Proiectul 2 - Sistem pentru monitorizarea glicemiei în timpul sarcinii

Protocol de monitorizaresi testarea sistemului de semzori/ plan de dezvoltare pentru urmatorii ani

Ansamblu senzori Multi-potentiostat Senzorii Caseta in care se introduc senzorii pentru a face legatura cu MultiEmStat C-Multipotentiostat	Zona de depunere prooba de saliva
Inregistrarea a 5 probe in mod continuu cu cresterea curentilor de oxidare dupa adaugarea standardelor/probelor	Inregistrarea a 10 probe in mod continuu cu cresterea curentilor de oxidare dupa adaugarea a 10 standarde consecutive
Probe de pacienti incadrate pe domeniul 0-1000 µM in valori de concentratii si semnale joase <1µA, medii intre 1µA-2µA , inalte >2µA

Proiectul 3: Evaluarea riscului de naștere prematură datorat infecției cu HPV

Protocol de marcare floresceneta a probelor de la pacienti pentru detectia folosint sistemul microarray

(A) Rezultatele hibridizării ADN monocatenar marcat fluorescent (Cy5 - roșu) obținut prin PCR asimetric. (B) Rezultatele hibridizării ADN monocatenar marcat fluorescent (Cy3 – verde) obținut prin digestie cu Lambda exonuclează. Coloanele marginale marcate cu verde reprezintă controlul pozitiv al imobilizării sondelor pe chip-ul de microarray. Controlul negativ al hibridizării nu prezintă semnal fluorescent.

In lotul de gravide studiat, a fost identificata infectia cu cel putin o tulpina de HPV la 41 de persoane (28%)
Distributia pacientelor pe grupe de varsta Identificarea infectiei cu HPV	Identificarea infectiei cu HPV
Evolutia sarcinii la pacientele HPV pozitive vs

Proiectul 4 - Sistem multi-senzor de monitorizare a activitatii fetale pe parcursul sarcinii

Realizare sistem demonstrator  pentru monitorizarea miscarilor abdominale in sarcina

Proiectul 1 -  Screening prenatal neinvaziv folosind ADN fetal liber circulant extras din sânge matern
Director proiect component IMT: Dr. Razvan Pascu (Dr. Melania Popescu)

Avand in vedere obiectivul principal al proiectului de a detecta secvente ADN specifice obtinute prin izolarea ADN-ului fetal existent in sangele mamei in primele luni de sarcina, ceea ce presupune analiza unor concetratii de ordinul picomolar gasirea unei metode de amplificare a semnalului SPR este necesara.
Pentru acesta amplificarea semnalului poate fi obținută prin utilizarea unor molecule mai mari  ce pot fi obtinute in doua moduri: (i) introducerea unor secvente ADN specifice denumite helpinguri sau (ii) conjugarea unor nanorodurilor de aur proba de interes.

i). S-au imobilizat sonde ssDNA cu lungimi și concentrații diferite pe suprafața de Au. Prin aceste masuratori am investigat influența numărului de perechi de baze (pb) asupra proceselor de imobilizare și hibridizare ADN. Primul set de teste a urmarit obtinerea unor indicatii clare legate de dimensiunile moleculor ce pot fi detectate la concetratiile necesare de interes.

Prin atașarea fragmentelor ADN monocatenar de suprafața filmului de aur, am studiat modificările raspunsului SPR pentru trei sonde ADN având dimensiuni diferite, 21, 134 și respectiv 187 pb.

Sensograme corespunzătoare imobilizării ADN pe suprafața senzorului de Au
Cea mai mică concentrație determinată a fost 10nM pentru secvența AND de dimensiune 187bp. Pentru a evidenția rolul masei moleculare asupra limitei de detecție SPR, a fost utilizată fracția V a albuminei serice bovine (BSA), cu MW = 68 kDa. Rezultatele confirmă că limita de detecție poate fi scăzută utilizând molecule cu masă moleculară mare. Astfel, cea mai diluată probă detectabilă a avut concentrația de 10 pM, pentru ea înregistrându-se un răspuns maxim de ~150, după 20 min.   Sensogramă corespunzătoare concentrațiilor variate de BSA

ii). A doua metoda de amplificare a semnalului prin conjugarea cu AuNRs a fost testa pentru BSA pentru a se ajunge la o scadere mai mare a limitei de detectie. Interacțiunea nanorodurilor de aur (AuNRs) cu proteina albumina serică bovină (BSA) la pH fiziologic este investigată folosind ca buffer MgCl2 pentru obtinerea dilutiilor det  BSA@AuNRs de la concentrația 1 uM pană la 1 fM

Sensograme corespunzătoare a) concentrațiilor variate de BSA@AuNRs	Sensograme corespunzătoare b) Amplificare semnal folosind AuNRs

Rezultatele au confirmat că limita de detecție  moleculelor cu greutate moleculară mare poate fi redusă prin modificarea cu nanoparticule care sunt responsabile de promovarea amplificării suplimentare a semnalului.

In proiectarea si realizarea structurii test s-a tinut cont de doua directii principale: construirea unor lame cat mai mici astfel incat consumul de material sa fie cat mai mic, cu impact evident in costul de productie al lamei microarray, dar si optinerea unui model de lama ce poate fi introdusa intr-un godeu proiectat anterior astfel incat tot procesul ulterior de hibridizare sa fie cat mai eficient. Astfel a fost creata o incinta de tip godeu, in care lama sa poata fi asezata si solutia de hibridizare impreuna cu probele sa fie adaugata deasupra, in cantitate suficienta, ulterior poate avea loc o agitare eficienta necesara unei hibridizari cat mai bune. Dimensiunile actuale ale lamei de siliciu folosita sunt: 3,5mm x 3,5mm, distanta la care a fost scrisa  fiecare sonda fata de celelalte sonde fiind: 500µm. Pentru realizarea incintei a fost proiectata si realizata o matrita cu o imprimanta 3 D pentru a se obtine camere de hibridizare individuale pentru fiecare chip testat si evitarea contaminari probelor.
	Imagine molding cu godeuri in PDMS
Pentru marcarea florescenta a probelor s-a constatat ca o eficienta mai mare si o concentratie mai mare poate fi obtinuta prin folosirea kitului de marcare fluorescenta prin metoda PCR, Cy3 PCR Labeling Kit de la Jena Bioscience ce foloseste inglobarea nucleotidelorCy3-dUTP marcate fluorescent in timpul reactiei PCR, rezultand un amplicon ce contine cateva nucleotide marcate fluorescent cu fluorocromul CY3. Reactia PCR a fost efectuata pe echipamentul BioradiCycler. Pentru reactia PCR au fost folositi primerii specifici pentru tulpina HPV16: Forward Primer: CGC ACA AAA CGT GCA TCG GCT ACCcu lungime 24 pb si temperatura de annealing73 grade celsius Reverse Primer: TGG GAG GCC TTG TTC CCA ATG GA cu lungime 23pb si temperatura de annealing 72.5 grade celsius Ampliconul rezultat in urma reactiei de amplifcare avand lungimea de 217pb si incorporate in interiorul sau dUTP-CY3 Pentru verificarea PCR a fost realizata o electroforeza in gel de agaroza	... Electroforeza apliconului cu dimensiune 217pb

Microchipuri cu sonde tinta pentru probele testate pentru HPV16 prin tehnologie microarray au avut incorporate sonte test pentru control pozitiv si replici identice  de concetratii diferite cu sonde specifice HPV16.

		..
Imagini cu sondele fluorescente utlizate cu rol de sonde-control		Imagini lame cu ADN fluorescent hibridizat cu sonda complementara imobilizata pe lama

Coloanele din cele 2 margini (stanga dreapta) sunt controalele fluorescente imobilizate, iar in cele 4 coloane din mijloc se observa cum a hibridizat ADN-ul fluorescent monocatenar de lungime 217b provenit de la ampliconul de 217pb.
Rezultatele obtinute prin tehnologie microarray au fost validate prin RT-PCR si secvențiere Sanger.
Testarea preliminara a dispozitivelor pentru diagnostic prenatal pentru detectia infectatii cu HPV din probe reale va fi realizata prin includerea de catre partenerul IOMC a 140 de paciente cu risc de nastere prematura. Includerea in studiu a pacientilor s-a realizat cu respectarea normelor etice nationale si international in vigoare. Probele au fost prelevate si prelucrate in devedea extragerii ADN-ului de catre partenerii.

Diseminare rezultate:

• “The influence of molecular weight of ssDNA-SRY and BSA on SPR signal amplification”, Elena Constantin, Melania Popescu, Monica Simion, EuroNanoForum 2019
• “Label free detection of protein using SPR signal”, Elena Constantin, Melania Popescu, Monica Simion, NN 2019 - 16th International Conference on Nanosciences & Nanotechnologies, 2019
• “Enhancement of SPR signal using gold nanorods”, Elena Constantin, Melania Popescu, Monica Simion, Adina Boldeiu, Iuliana Mihalache, International Semiconductor Conference (CAS), Sinaia, 9-11 Oct., 2019
•  „Microarray flexible platform manufactured on cotton fabrics coated with ultrathin ZnO layer”, Melania Popescu, Florin Nastase, Elena Constantin, Monica Simion, Cosmin Romanitan, Marian Popescu, Conference of the Romanian Electron Microscopy Society - C.R.E.M.S., 23-25.10.2019, Poiana Brasov